'Ruđer', PCR i ja

'Ruđer', PCR i ja

Kad sam bila, pa recimo, desetak godina stara, posebno su me fascinirale dvije stvari: Institut Ruđer Bošković i operacijska sala! Časna riječ.

Svaki put kad bismo prolazili Bijeničkom cestom na putu za Mirogoj s divljenjem bih gledala u portu tamo nekog skrivenog zdanja, na kojoj je pisalo: 'Institut Ruđer Bošković'. Činilo mi se da se iza te porte događaju nevjerojatne i ludo zanimljive stvari. Ono – institut, pa sama riječ već sve govori!

Iako su se neki članovi moje obitelji bavili znanošću, nitko nije radio na IRB-u, niti mi je o tome nešto posebno pričao... Ta fascinacija bila je samo moja. Uskoro sam upoznala susjedu, tri kuće od moje, koja mi je rekla da radi na Institutu Ruđer Bošković! Nevjerojatno!!! Blaaago njoj, pomislila sam u trenutku kad nisam znala ni u koju srednju školu ću ići, a kamoli što ću u životu raditi. 

Nakon toga, nije prošlo ni petnaest godina i... eto mene upravo na tom institutu. Nakon izrade diplomskog rada, ostvarila mi se velika želja da se i formalno zaposlim!!! Nisu mi puno značila poznata svjetska sveučilišta i slično... Ruđer Bošković – to je to! 

Na početku mog radnog vijeka, 1991. godine, počeli smo se useljavati u, tada potpuno novu zgradu, V. krilo. Laboratoriji su bili prazni, a mi smo pomalo unosili neku sitnu opremu.

Šefovi su neko vrijeme bili u SAD-u, odakle su donijeli informaciju, kao i određene reagense za, tada, potpuno novu metodu koja se zove lančana reakcija polimerazom, ili kraće - PCR! 

U današnje doba, koroni-zahvaljujući, vjerojatno već i vrapci na grani znaju, ili su barem čuli, za PCR. No, tada je to zaista bila jako, jako nova metoda, otkrivena sredinom 80-tih godina, a već 1993. godine je za njeno otkriće dodijeljena Nobelova nagrada.

Metodom PCR moguće je umnožiti/kopirati točno određen dio molekule DNA u jako velikom broju kopija, in vitro – bez kloniranja. Samo umnažanje provodi se kroz veći broj ponavljanja/ciklusa, pri čemu se sa svakim ponavljanjem broj kopija željenog odsječka eksponencijalno povećava. 

Metoda je vrlo jednostavna. Potrebno je, osim željene molekule DNA-matrice, imati dvije kratke molekule DNA koje su komplementarne početnom i završnom dijelu odsječka koji se kopira, enzim koji sudjeluje u reakciji sinteze DNA, građevne dijelove molekule DNA te pufersku otopinu. Pri tome je ključno kontrolirati temperaturu reakcije i vrijeme trajanja pojedinog dijela ciklusa na točno određen način.

Prvenstveno je, naime, potrebno da se dva lanca molekule DNA matrice razdvoje, kako bi se za njih vezale ove dvije kratke molekule-početnice, a što se postiže njenim zagrijavanjem na više od 90°C (denaturacijom). Potom se temperatura snižava kako bi se početnice vezale za matricu (npr. na 55 ° C), a zatim ponovno prilagođava uvjetima koji su optimalni za djelovanje enzima.

Kako bi se olakšala provedba ovih reakcija (dakle, barem tri promjene temperature u 20 do 40 ciklusa), konstruiran je uređaj (eng. thermal cycler) koji omogućava upravo to - brzu i preciznu promjenu temperature u odgovarajućim epruvetama.

Mi takav uređaj u tom trenutku nismo imali...

No, s obzirom na to da su Hrvati, često zbog pomanjkanja sredstava ili opreme, oduvijek navikli na česte improvizacije u pokusima i mi smo se brzo snašli: epruvetice volumena 0.5 mL, s reakcijskom smjesom, stavili smo u improvizirani nosač, uključili dvije vodene kupelji koje su radile na nižoj temperaturi te džezvu za kavu u kojoj je bila kipuća voda za denaturaciju.

Uz pomoć štoperice mjerili smo vrijeme i tridesetak puta opetovano selili nosač iz jedne 'kupelji' u drugu! Sve skupa trajalo je barem 2 sata... i reakcija je uspjela!!  Kad je konačno nabavljen adekvatan uređaj bili smo jako ponosni i čuvali ga 'k'o oko u glavi'. Sjećam se, na primjer, kako je tada počeo Domovinski rat, za vrijeme uzbuna kolegica je dotični uređaj spremala na najsigurnije mjesto u zgradi!! Ali, o operacijskoj sali – drugom prilikom. 

dr. sc. Marijeta Kralj
Laboratorij za eksperimentalnu terapiju
Zavod za molekularnu medicinu

Ova stranica koristi kolačiće. Neki od tih kolačića nužni su za ispravno funkcioniranje stranice, dok se drugi koriste za praćenje korištenja stranice radi poboljšanja korisničkog iskustva.
Za više informacija pogledajte naše uvjete korištenja.

  • Kolačići koji su nužni za ispravno funkcioniranje stranice. Moguće ih je onemogućiti u postavkama preglednika.